2025年2月21日，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院史岸冰課題組針對細胞極性分泌晚期階段的調(diào)控開展研究，發(fā)現(xiàn)了一種此前未見報道的分泌囊泡錨定捕獲機制。這項發(fā)表在Journal of Cell Biology上的研究（題為：RAB-10 cooperates with EHBP-1 to capture vesicular carriers during post-Golgi exocytic trafficking）大量運用遺傳學(xué)分析，深入解析RAB-10/Rab10及其效應(yīng)蛋白EHBP-1/Ehbp1如何通過協(xié)作，調(diào)控細胞內(nèi)脂蛋白分泌囊泡向細胞膜的定向運輸過程，為理解極性細胞中定向分泌調(diào)控提供了新的科學(xué)細節(jié)。

研究團隊選擇秀麗線蟲、人類肝細胞作為模式體系，通過一系列細胞學(xué)實驗策略，探索了RAB-10/Rab10和EHBP-1/Ehbp1在極性脂蛋白分泌過程中的作用機制。

本研究采取了RNAi反向遺傳篩選策略，首先對22個已知的Rab家族蛋白進行了篩查。為避免基因敲除帶來的嚴重表型影響實驗判讀，對于一些關(guān)鍵基因如snap-29、snap-1、sec-5等，研究人員特別選取了在線蟲L2-L3期進行RNAi處理的策略，這樣可以在young adult階段觀察到相對溫和的表型。在篩選中，研究人員發(fā)現(xiàn)RAB-10的缺失導(dǎo)致卵黃載脂蛋白VIT-2在細胞內(nèi)異常累積，同時體腔中的VIT-2含量顯著降低。此前研究提及的調(diào)控頂膜端分泌的RAB-10旁系同源蛋白RAB-8的缺失并未導(dǎo)致類似表型，而RAB-5的缺失則導(dǎo)致VIT-2在體腔中累積但卵母細胞中含量降低，提示其可能參與卵母細胞的脂蛋白內(nèi)吞過程。這種系統(tǒng)性的篩選不僅確定了RAB-10在分泌過程中的特殊作用，也幫助繪制出了不同Rab蛋白在極性分泌-內(nèi)吞網(wǎng)絡(luò)中的功能圖譜。為了研究RAB-10的分泌調(diào)控效應(yīng)，研究團隊進一步對已知的RAB-10互作蛋白進行了篩選，包括EHBP-1、TBC-2、CNT-1、HUM-2等在腸道中參與循環(huán)的蛋白，以及JIP-1、KLC-1、KLC-2、KLP-4等在神經(jīng)軸突發(fā)育中起作用的蛋白。通過這輪篩選，他們發(fā)現(xiàn)只有EHBP-1缺失會導(dǎo)致VIT-2分泌缺陷，這一發(fā)現(xiàn)將研究重點指向了EHBP-1。

在技術(shù)方面，研究人員利用heat shock-inducible CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了ehbp-1條件性突變體，實現(xiàn)了對EHBP-1功能的時空特異性調(diào)控。同時，研究人員通過CRISPR-Cas9介導(dǎo)的同源重組，在不影響基因原有表達調(diào)控的前提下，將mNeonGreen-3xFlag和wrmScarlet標(biāo)簽分別整合到VIT-2和RAB-10的基因位點，獲得了內(nèi)源標(biāo)記的融合蛋白。利用高分辨率共聚焦顯微鏡進行活體成像，研究人員觀察到在RAB-10或EHBP-1缺失的線蟲中，原本應(yīng)該分泌到體腔的卵黃蛋白VIT-2在腸道細胞內(nèi)異常累積。進一步的透射電鏡分析揭示，突變體中出現(xiàn)大量直徑約200nm的電子致密囊泡，這些囊泡的數(shù)量較野生型顯著增加，但形態(tài)保持不變。這一發(fā)現(xiàn)暗示RAB-10和EHBP-1可能參與調(diào)控脂蛋白囊泡的運輸過程，而非囊泡的形成。

為了理解RAB-10和EHBP-1的作用機制，研究團隊開展了一系列生化和細胞生物學(xué)實驗。表達并純化了RAB-10和EHBP-1的各個功能結(jié)構(gòu)域，通過體外結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)，EHBP-1的CC結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識別處于GTP結(jié)合狀態(tài)的RAB-10，EHBP-1的C2結(jié)構(gòu)域可以與膜脂PI(4,5)P2結(jié)合，這種結(jié)合對EHBP-1定位于循環(huán)內(nèi)吞體至關(guān)重要。研究人員建立了基于TIRF顯微鏡的實時觀察系統(tǒng)，直接觀察EHBP-1介導(dǎo)的囊泡捕獲過程。他們將帶有StrepII標(biāo)簽的EHBP-1固定在包被生物素的載玻片上，然后加入裝載了熒光標(biāo)記的RAB-10的人工脂質(zhì)體。實驗結(jié)果清楚地顯示，只有當(dāng)RAB-10被非水解GTP類似物GMP-PNP活化時，脂質(zhì)體才能被有效捕獲。這一體外重構(gòu)實驗不僅證明了EHBP-1具有囊泡捕獲功能，還揭示了這一過程依賴于RAB-10的活性狀態(tài)。

在調(diào)控機制方面，研究人員通過遺傳學(xué)篩查發(fā)現(xiàn)了一個新的關(guān)鍵分子LST-6/DENND5。通過熒光標(biāo)記的鳥嘌呤核苷酸MANT-GDP釋放實驗，他們證實LST-6具有特異的GEF活性，能夠促進RAB-10從GDP結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)換為活性的GTP結(jié)合狀態(tài)。有趣的是，與已知調(diào)控循環(huán)運輸?shù)腄ENN-4/GEF相比，LST-6顯示出不同的底物特異性和亞細胞定位模式，暗示細胞可能通過不同的GEF來精確調(diào)控同一Rab介導(dǎo)的不同運輸途徑。為了確認這一機制的進化保守性，研究人員轉(zhuǎn)向了人類細胞模型。他們利用RNA干擾技術(shù)在HepG2和Huh7肝細胞中分別敲低RAB-10或DENND5的表達。實驗結(jié)果顯示，無論是細胞內(nèi)還是培養(yǎng)基中的載脂蛋白apoB水平都顯著降低，但mRNA水平保持不變。有趣的是，使用溶酶體抑制劑bafilomycin A1處理可以部分逆轉(zhuǎn)細胞內(nèi)apoB的減少，而蛋白酶體抑制劑MG132的效果較弱，這表明分泌受阻的脂蛋白主要通過溶酶體途徑進行降解。

在研究過程中，團隊還利用AlphaFold2-Multimer對RAB-10和EHBP-1的復(fù)合物結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，為理解兩個蛋白的相互作用界面提供了重要線索。在細胞水平，他們采用spinning disk共聚焦顯微鏡進行實時成像，發(fā)現(xiàn)在EHBP-1缺失的細胞中，RAB-10標(biāo)記的囊泡呈現(xiàn)出更加活躍的分裂行為，而融合頻率保持不變。這一發(fā)現(xiàn)揭示了EHBP-1在維持分泌膜區(qū)室穩(wěn)定性方面的重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)，這一分泌通路具有顯著的組織特異性和極性特征。在線蟲腸道上皮細胞中，RAB-10-EHBP-1主要調(diào)控基底外側(cè)分泌，而對頂膜端分泌沒有明顯影響。這種極性特異性的發(fā)現(xiàn)啟發(fā)研究人員思考：細胞是否存在多套平行的分泌調(diào)控系統(tǒng)？后續(xù)，通過系統(tǒng)性篩查分泌相關(guān)基因，有助于逐步繪制出一幅較為完整的分泌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

在代謝性疾病中，脂蛋白分泌異常是一個普遍存在的問題。通過深入理解Rab介導(dǎo)的分泌調(diào)控機制，可能為這些疾病的治療提供新的靶點和策略。為此，研究團隊正在進一步拓展研究，利用光遺傳工具研究Rab10活性的時空調(diào)控特征，并通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定更多的調(diào)控分子，為闡明細胞極性運輸?shù)幕驹硖峁┻M一步的線索，幫助理解細胞內(nèi)物質(zhì)運輸系統(tǒng)的精確性和復(fù)雜性。這一類研究工作也將為理解其他細胞過程提供思路，如在極性細胞中，不同膜結(jié)構(gòu)域的形成和維持可能也依賴于類似的分子捕獲機制。在免疫細胞中，細胞因子的定向分泌可能也受到類似通路的調(diào)控。隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是成像系統(tǒng)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法的進步，以及人工智能輔助的數(shù)據(jù)分析方法的應(yīng)用，將有力促進學(xué)界對細胞分泌調(diào)控機制更深入的認識。

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系史岸冰、嚴雁玲為論文通訊作者，博士生劉帥、魏頡為論文第一作者。

原文鏈接：https://doi.org/10.1083/jcb.202410003