8月28日，華中科技大學基礎醫(yī)學院史岸冰課題組在Nature Aging上發(fā)表了題為“與年齡相關(guān)的RAB-10功效下降會損害腸屏障的完整性”（Age-associated decline in RAB-10 efficacy impairs intestinal barrier integrity）的研究論文，闡釋了細胞內(nèi)膜運輸效能在衰老相關(guān)的生理學變化中如何影響腸道屏障完整性。

腸道在生物體與外部威脅（如微生物和毒素）相互作用中扮演著關(guān)鍵的屏障角色。然而，隨著年齡的增長，動物和人類的腸道功能逐漸減弱，腸道屏障功能障礙可導致多種疾病的發(fā)生，包括炎癥性腸病、慢性心力衰竭和哮喘。研究顯示，延長壽命的干預措施，如降低環(huán)境溫度或限制飲食，可以延緩動物腸道屏障功能的下降。近期，通過對模式生物秀麗線蟲的研究，科學家們發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，線蟲中的熱休克轉(zhuǎn)錄因子HSF-1喪失，導致ACT-5肌動蛋白磷酸化水平上升，加速了腸道頂膜端微絲骨架網(wǎng)絡的衰退，損害了腸道屏障功能。

腸上皮屏障功能障礙的一個關(guān)鍵特征是其無法維持選擇性通透性，這在衰老過程中較為普遍。比如，老齡大鼠腸絨毛微血管的通透性明顯增加；老年人群小腸屏障的滲透性增加，導致與年齡相關(guān)的免疫紊亂。通過在模式系統(tǒng)中開展的研究，學界認識到腸上皮屏障的通透性與細胞間連接的結(jié)構(gòu)和功能完整性密切相關(guān)。

脊椎動物腸細胞間連接包括緊密連接和粘附連接，參與維持腸道屏障的完整性和細胞間通訊。秀麗線蟲和脊椎動物的腸上皮細胞間連接在組成和功能上相似。線蟲腸上皮具有單一的頂膜端連接，其功能兼顧緊密連接和粘附連接，是闡明細胞連接組裝和功能的理想研究模型。線蟲頂膜端連接包含三個主要的組成域（圖1）：頂膜端區(qū)、粘附連接域和DLG-AJM域。其中，粘附連接域的cadherin-catenin復合物由HMR-1/cadherin、HMP-2/β-catenin、HMP-1/α-catenin和JAC-1/p120組成，DLG-AJM域位于粘附連接域的基膜側(cè)，可能參與調(diào)節(jié)屏障通透性。2018年，史岸冰課題組針對HMP-1/α-catenin分布調(diào)控的研究發(fā)現(xiàn)，為了將HMP-1精確定位到頂膜端連接區(qū)，必須精確地調(diào)節(jié)內(nèi)吞循環(huán)調(diào)控因子RAB-10/Rab10的活性。當干擾RAB-10的活化時，會導致HMP-1在側(cè)膜上異常分布，引發(fā)側(cè)膜紊亂和過度延伸。

SDPN-1是哺乳動物PACSINs和果蠅Syndapin的線蟲同源物，已知促進內(nèi)吞體上肌動蛋白聚合。在成年小鼠中，PACSIN2位于腸細胞的頂膜，調(diào)節(jié)內(nèi)吞作用和微絨毛形態(tài)。

研究表明，SDPN-1和RAB-10之間存在潛在功能關(guān)系。SDPN-1缺失會導致RAB-10在細胞質(zhì)中累積，而RAB-10的缺失會導致SDPN-1在細胞質(zhì)中擴散，提示SDPN-1是RAB-10功能的潛在負調(diào)控因子，而RAB-10是SDPN-1的潛在膜招募因子。然而，本研究發(fā)現(xiàn)SDPN-1的膜定位實際上并不是由RAB-10決定，RAB-10缺失細胞中的SDPN-1彌散結(jié)構(gòu)是內(nèi)吞體形成之前的簇狀前體膜結(jié)構(gòu)，SDPN-1仍附著于這些膜結(jié)構(gòu)，并非是蛋白的細胞質(zhì)彌散。RAB-10缺失后SDPN-1的膜質(zhì)比并沒有發(fā)生變化，無論有無RAB-10存在SDPN-1始終與膜標記物PI(4,5)P2有很好的共定位。上述證據(jù)表明，SDPN-1的內(nèi)吞體膜定位主要由磷酸肌醇PI(4,5)P2決定，RAB-10與SDPN-1膜募集無關(guān)。

進一步，研究人員發(fā)現(xiàn)衰老動物腸道通透性的增加主要是由于粘附連接的結(jié)構(gòu)與功能障礙所致，這與RAB-10缺失造成腸道通透性增加表型一致，提示RAB-10效能在衰老線蟲中降低，導致腸道粘附連接完整性受損，且RAB-10功能下降很可能與SDPN-1有關(guān)。與此推論一致，SDPN-1的表達在衰老動物中出現(xiàn)大幅度上調(diào)，SDPN-1缺失可導致RAB-10及其GEF蛋白DENN-4在內(nèi)吞體上積累，而SDPN-1過表達會造成RAB-10和DENN-4內(nèi)吞體標記水平降低。綜合這些證據(jù)，表明SDPN-1確實是RAB-10功能的負調(diào)控因子。進一步的實驗發(fā)現(xiàn)，SDPN-1僅與無活性形式的RAB-10(GDP)相互作用，且與RAB-10存在弱共定位，SDPN-1與DENN-4的DENN結(jié)構(gòu)域有相互作用，與DENN-4有非常好的共定位。

為了解RAB-10、SDPN-1和DENN-4/GEF三者之間的功能關(guān)系，研究人員通過蛋白體外競爭和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(F?rster resonance energy transfer, FRET)等多類型實驗表明SDPN-1與DENN-4/GEF競爭結(jié)合RAB-10，進而抑制RAB-10的激活。進一步，研究人員通過AlphaFold2-Multimer預測并驗證了SDPN-1與DENN-4競爭RAB-10(GDP)上的結(jié)合界面，降低了DENN-4的GEF效能。

研究提示，SDPN-1/PACSINs可以通過其F-BAR結(jié)構(gòu)域介導的自我互作形成寡聚物。為此，研究人員通過粒徑排除色譜法(size exclusion chromatography, SEC)和多角度光散射(multi-angle light scattering, MALS)聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)SDPN-1存在二聚和六聚兩種寡聚態(tài)。蛋白互作實驗表明，SDPN-1主要利用其二聚體形式與DENN-4競爭結(jié)合RAB-10(GDP)，而六聚體可能是細胞內(nèi)儲藏庫或自我約束形式。與上述生化、生物物理研究結(jié)論一致，SDPN-1敲低可緩解衰老相關(guān)的粘附連接完整性及腸屏障通透性異常。

最后，研究人員發(fā)現(xiàn)SDPN-1對RAB-10的抑制作用需要KGB-1/JUN激酶，年齡相關(guān)的KGB-1/JUN活性抑制解除是SDPN-1行使RAB-10抑制效能的必要條件，KGB-1可能通過改變SDPN-1的寡聚態(tài)來增強其抑制效能。

綜上所述，這項研究在分子水平揭示了衰老相關(guān)的內(nèi)吞循環(huán)運輸效能變化對粘附連接組裝的影響，從細胞內(nèi)膜動態(tài)調(diào)控的角度揭示了衰老影響腸屏障選擇性通透性的分子過程，為衰老如何影響腸屏障完整性提供了獨特的見解。

華中科技大學博士后研究員張靜是這項研究的第一作者，課題組劉行博士與史岸冰教授為本研究的通訊作者。