腸道上皮依賴腸道干細(xì)胞（Intestinal Stem Cell，ISC）維持組織穩(wěn)態(tài)、修復(fù)損傷并適應(yīng)環(huán)境挑戰(zhàn)^[1]。ISC異常增殖可驅(qū)動(dòng)結(jié)直腸癌發(fā)生，而ISC耗竭則與潰瘍性結(jié)腸炎、放射性腸病及年齡相關(guān)的上皮退化密切相關(guān)。盡管其臨床意義重大，但I(xiàn)SC如何在腸道發(fā)育過程中被選擇出來，并實(shí)現(xiàn)規(guī)律的空間排布？目前人們對(duì)ISC的選擇機(jī)制還知之甚少。

在經(jīng)典模式生物果蠅的腸道發(fā)育過程中，幼蟲腸道AMP（Adult Midgut Progenitor Cell）細(xì)胞增殖形成AMP島^[2]。既往假說認(rèn)為每個(gè)AMP島會(huì)“選出”一個(gè)細(xì)胞成為未來的ISC^[3]。然而，這一理論還未被實(shí)驗(yàn)所證明。而在哺乳動(dòng)物小鼠模型中，盡管已有研究表明胚胎期E13.5階段的ISC選擇與Wnt信號(hào)通路激活密切相關(guān)^[4]，但I(xiàn)SC如何實(shí)現(xiàn)間隔性選擇仍需進(jìn)一步探究。

2025年12月3日，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院郭崢教授課題組與華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藺蓉教授課題組合作在Science Advances雜志在線發(fā)表了題為Drosophila and mouse intestinal stem cells are spatio-temporally specified by Notch suppression and Wnt activation的研究論文。該研究闡明了ISC命運(yùn)選擇的核心機(jī)制：Wnt與Notch信號(hào)通路的時(shí)空協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)了ISC的命運(yùn)決定：Wnt激活區(qū)域劃定了選擇范圍，而范圍內(nèi)的上皮細(xì)胞通過Notch信號(hào)通路進(jìn)行命運(yùn)選擇。

該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)果蠅ISC在蛹形成后（After puparium formation，APF）的8小時(shí)到12.5小時(shí)內(nèi)被選擇出來。在這有限的時(shí)間窗口，從約900個(gè)AMP島（約6000個(gè)AMP細(xì)胞）中，“稀疏”選擇出大約150個(gè)ISC，隨后ISC通過對(duì)稱分裂擴(kuò)大ISC池，至43h APF，產(chǎn)生了約600個(gè)ISC。推翻了前人“一AMP島，一ISC”的經(jīng)典假說。

圖1 ISC的命運(yùn)選擇軌跡和命運(yùn)選擇過程中主要通路變化

A.t-SNE 可視化圖顯示基于標(biāo)記基因表達(dá)對(duì)各細(xì)胞類型進(jìn)行著色。樣本量為 5384 個(gè)細(xì)胞核。B.中腸上皮細(xì)胞的擬時(shí)序軌跡分析：按注釋細(xì)胞類型著色的發(fā)育軌跡，箭頭表示細(xì)胞命運(yùn)選擇的方向。C.ISC-p1/p2命運(yùn)標(biāo)記的基因表達(dá)熱圖和按照擬時(shí)序順序聚類的ISC分支的3個(gè)信號(hào)模塊。中間代表AMP開始分化的偽時(shí)間。

通過對(duì)果蠅蛹期8-12小時(shí)APF的腸道進(jìn)行單細(xì)胞核測(cè)序分析，該團(tuán)隊(duì)首次繪制了腸道發(fā)育早期上皮不同細(xì)胞命運(yùn)選擇的軌跡圖（圖1.A和B）。結(jié)果提示ISC命運(yùn)選擇可能與Notch、Wnt、EGFR信號(hào)通路相關(guān)（圖1.C）。接下來，研究團(tuán)隊(duì)通過一系列細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和譜系追蹤實(shí)驗(yàn)證實(shí)：ISC的選擇必須同時(shí)滿足兩個(gè)條件，即Notch信號(hào)通路的抑制與Wnt信號(hào)通路的激活。當(dāng)同時(shí)敲除Notch信號(hào)通路并激活Wnt信號(hào)通路后，所有AMP均被選擇成為了GFP+ 的ISC（圖2. A）。此外，在哺乳動(dòng)物中，隱窩Lgr5+ ISC中的APC突變會(huì)持續(xù)激活Wnt信號(hào)通路，導(dǎo)致腸道未分化腫瘤的產(chǎn)生[5]。該團(tuán)隊(duì)在果蠅ISC命運(yùn)選擇過程中突變APC，同樣產(chǎn)生了高增殖，低分化的腫瘤樣細(xì)胞團(tuán)，對(duì)應(yīng)了在哺乳動(dòng)物腸隱窩中觀察到的腫瘤發(fā)生情況（圖2.B）。該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)EGFR信號(hào)通路影響ISC的增殖，但并不參與ISC的選擇過程。

圖2 ISC的命運(yùn)選擇及在命運(yùn)選擇時(shí)誘導(dǎo)Apc突變會(huì)產(chǎn)生未分化腫瘤

A.在12.5h APF 時(shí)，對(duì)照組（esgts>GFP）和 esgts>NotchRNAi+armΔN 中 ISC（esg>GFP）的代表性圖像。B.Apc1^Q8Apc2^19.3MARCM克隆的代表性圖像，在幼蟲 EL3 階段開始誘導(dǎo)克隆，在出蛹后14天檢測(cè)。

那么，Wnt和Notch信號(hào)通路是如何協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)約1/40的ISC選擇概率？該團(tuán)隊(duì)揭示，來源于腸道中部的環(huán)形肌肉，與meconium（由幼蟲中腸腸細(xì)胞包裹幼蟲食物所形成）兩端分泌的Wg為ISC的選擇提供了“前-中-后”特定空間分布的Wnt信號(hào)激活區(qū)域（圖3.A）。在這些Wnt激活區(qū)域中，Notch信號(hào)介導(dǎo)的側(cè)向抑制僅在相鄰細(xì)胞中選擇出一個(gè)AMP成為ISC。通過這種時(shí)空配合的選擇機(jī)制，保證了腸道中稀疏選擇出固定數(shù)目的ISC及其相對(duì)固定的ISC選擇位置（圖3.B）。

圖3 Notch和Wnt信號(hào)決定腸道ISC的數(shù)目和空間位置

A.12.5h APF時(shí)，腸道中wg>GFP表達(dá)的代表圖像。上圖：包含胎糞的中腸。下圖：分離出來的胎糞。B.腸道ISC命運(yùn)選擇的模型：（上圖）肌肉和胎糞中的Wg分泌建立了ISC選擇的區(qū)域。Notch信號(hào)在這些區(qū)域內(nèi)介導(dǎo)側(cè)向抑制，以完善ISC的命運(yùn)選擇。（下圖）野生型、Wnt過表達(dá)和Notch抑制條件下的ISC分布模式。

在小鼠胚胎腸道發(fā)育過程中，Wnt信號(hào)激活促進(jìn)Lgr5+ ISC的選擇[4]。鑒于在果蠅腸道中抑制Notch信號(hào)通路促進(jìn)了ISC的選擇，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索了在小鼠胚胎腸道發(fā)育中抑制Notch信號(hào)通路對(duì)Lgr5+ ISC選擇的影響。實(shí)驗(yàn)表明，在胚胎第9.5天（E9.5）抑制Notch信號(hào)通路后，至E12.5時(shí)，絕大多數(shù)的腸道上皮均被選擇為Lgr5+ ISC。證明小鼠Lgr5+ ISC的選擇同樣需要抑制Notch信號(hào)通路（圖4.A）。在胚胎ISC選擇完成后的E16.5抑制ISC中Notch信號(hào)通路，導(dǎo)致新生小鼠腸道中 Lgr5-EGFP+ISC細(xì)胞顯著減少，同時(shí)杯狀細(xì)胞數(shù)目增加（圖4.B），這說明在ISC確立之后，Notch信號(hào)的作用發(fā)生了轉(zhuǎn)變：從早期限制ISC命運(yùn)，轉(zhuǎn)為維持ISC干性、阻止其分化為分泌型細(xì)胞。

圖4 胚胎發(fā)育過程中，Notch 抑制有助于ISC選擇，但隨后導(dǎo)致其分化

A.縱切面顯示E10.5至E12.5期間對(duì)照組和DAPT處理小鼠E13.5腸道的Lgr5-EGFP⁺ 染色情況。B.E16.5至E18.5期間對(duì)照組和DAPT治療組小鼠P0小腸中Lgr5-EGFP⁺ 和杯狀細(xì)胞的Muc2染色。

綜上所述，該團(tuán)隊(duì)的研究揭示，在時(shí)空精準(zhǔn)配合下，通過“抑制Notch、激活Wn”這一組合信號(hào)，可在腸道發(fā)育過程中稀疏選擇ISC，且該機(jī)制從昆蟲到哺乳動(dòng)物高度保守。這提示了果蠅蛹期中腸發(fā)育過程與哺乳動(dòng)物隱窩基部更為相似，兩者在ISC命運(yùn)決定階段均依賴Wnt與Notch信號(hào)的協(xié)同作用，隨后均需要Notch信號(hào)維持ISC干性。而果蠅成蟲腸道上皮的穩(wěn)態(tài)維持則類似于哺乳動(dòng)物小腸的TA區(qū)和其產(chǎn)生的絨毛區(qū)域，其主要依賴Notch信號(hào)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞分化，較少需要Wnt信號(hào)的參與。這種時(shí)空上的對(duì)應(yīng)關(guān)系表明，果蠅蛹期中腸可以作為研究哺乳動(dòng)物小腸隱窩中ISC增殖和表皮穩(wěn)態(tài)維持的保守模型。該研究所揭示的Notch信號(hào)通路在ISC選擇和維持過程中所具有的截然相反功能，以及Wnt信號(hào)在ISC選擇過程中所扮演角色，為探索癌癥發(fā)生提供了新的研究視角。

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳系郭崢教授和華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藺蓉教授為本研究論文的共同通訊作者。華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院博士生吳悠為該論文第一作者。

原文鏈接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/41337595

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